溶液Ⅰ:葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部;EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性;可添加RNaseA消化RNA。
溶液Ⅱ
此步为碱处理。其中NaOH主要是为了溶解细胞,释放DNA,因为在强碱性的情况下,细胞膜发生了从双层膜结构向微囊结构的变化。SDS与NaOH联用,其目的是为了增强NaOH的强碱性,同时SDS作为阴离子表面活性剂破坏脂双层膜。这一步要记住两点:
第一,时间不能过长,因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断也会慢慢断裂;
第二,必须温柔混合,不然基因组DNA会断裂。
溶液Ⅲ
溶液III的作用是沉淀蛋白和中和反应。其中醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的钠离子而形成了PDS。
因为十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate)遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾(potassiumdodecylsulfate,PDS),而PDS是不溶水的,同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。
2M的醋酸是为了中和NaOH。基因组DNA一旦发生断裂,只要是50-100kb大小的片断,就没有办法再被PDS共沉淀了,所以碱处理的时间要短,而且不得激烈振荡,不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入,琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。
75%酒精主要是为了清洗盐份和抑制Dnase;同时溶液III的强酸性也是为了使DNA更好地结合在硅酸纤维膜上。